一、實驗室網(wǎng)絡(luò)設(shè)置
實驗室網(wǎng)絡(luò)由中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所國家流感中心和省級流感實驗室兩級組成。
二、實驗室條件及生物安全操作的要求
1.省級流感實驗室實驗條件及生物安全的操作要求
(1)實驗生物安全要求：安全Ⅱ級+(BSL-2級+)或安全Ⅲ級(BSL-3級)。
(2)特異性H5的RT-PCR病毒核酸檢測、血清學(xué)檢測中用到的血凝抑制實驗(HI)可以在安全Ⅱ級+(BSL-2級+)實驗室里操作。
(3)特異性H5的RT-PCR病毒核酸檢測在安全Ⅱ級+(BSL-2級+)實驗室的生物安全柜里提取病毒的核酸，進行病毒核酸檢測的實驗室要求請參照國家有關(guān)核酸檢測要求的規(guī)定。
(4)微量中和實驗、特異性H5的RT-PCR病毒核酸檢測陽性的采樣標本的病毒分離、尸檢標本的檢測必須在安全Ⅲ級(BSL-3級)實驗室里操作。
(5)省級流感實驗室實驗條件：具備進行禽流感相關(guān)臨床標本初篩所需的生物安全柜、離心機、PCR儀、電泳儀、紫外線檢測儀等配套設(shè)備。
2.國家流感中心
實驗生物安全要求：生物安全Ⅱ級+(BSL-2級+)和生物安全Ⅲ級(BSL-3級)實驗室。
3.省級流感實驗室職責(zé)
(1)禽流感采樣標本的臨床標本特異性H5的RT-PCR病毒核酸檢測；
(2)禽流感H5的血清學(xué)檢測工作;
(3)特異性H5的RT-PCR病毒核酸檢測陽性標本的病毒分離必須在生物安全Ⅲ級(BSL-3級)實驗室；
(4)沒有生物安全Ⅲ級(BSL-3級)實驗室的，將標本送國家流感中心做病毒的分離工作。
4.國家流感中心實驗室職責(zé)
(1)國家流感中心設(shè)立在中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所流感室；
(2)對各省報告的禽流感疑似病例或確診病例進行復(fù)核、確認；
(3)對不具備禽流感病毒分離條件的省份送檢標本的檢測、分離和確認；
(4)對需要做微量中和實驗的血清標本進行微量中和試驗；
(5)對各省級實驗室檢測人員的培訓(xùn)；
(6)對各省級流感實驗室的質(zhì)量控制。
三、原始標本采集
1.標本采集人員
醫(yī)療機構(gòu)的醫(yī)生、護士或當?shù)丶膊☆A(yù)防控制中心專業(yè)人員負責(zé)標本采集并填寫標本登記表，標本采集人員按照《禽流感職業(yè)暴露人員防護原則》做好個人防護。
2.標本采集種類和時限
(1)采集標本的種類：疑似禽流感患者的咽、鼻拭子或含漱液、血清以及死亡病例的尸檢肺組織、氣管分泌物。
(2)采集標本時間：
1)咽、鼻拭子或含漱液在發(fā)病的頭3天采集；
2)急性期血清在發(fā)病后7天內(nèi)采集，恢復(fù)期血清在發(fā)病后2-4周采集；
3)尸檢標本尸檢時采集。
3.標本的運送：所有采集的標本應(yīng)在醫(yī)院采集時立即分裝，一式二份，其中一份單獨保存，以備復(fù)核。采集的標本若不能在24小時內(nèi)送達，則應(yīng)盡快在-70℃以下保存。無-70℃條件的需在-20℃冰箱短時間暫存，并盡快聯(lián)系遞送標本。
4.標本采集的方法：詳見國標《流行性感冒診斷標準及處理原則》
四、送流感中心的標本包裝、運送與接收
1.標本的包裝
(1)標本必須放在大小適合的帶螺旋蓋內(nèi)有橡膠圈的塑料管里，擰緊。
(2)將密閉后的標本放入大小適合的塑料袋內(nèi)密封；每袋裝一份標本。
(3)直接在塑料管上用油性記號筆寫明樣本的種類、采樣時間、編號、姓名，同時也將標本有關(guān)信息填在禽流感人體標本送檢登記表，連同塑料管用另一塑料袋內(nèi)密封。
(4)將裝標本的密封袋放入專用運輸箱內(nèi)(或疫苗冷藏包)，放入冰排，然后以柔軟物質(zhì)填充，內(nèi)襯具吸水和緩沖能力的材料。同一患者2份以上的密封標本，可以放在同一個塑料袋內(nèi)再次做密封。若將進行病毒分離，可將密封好的裝有標本的容器直接放入液氮運輸罐內(nèi)運輸。所有容器必須印有生物危險標識。
2.標本運送
(1)航空或鐵路運送。
(2)專人專車運送：主要用于近距離樣品運送。
3.標本的接收
(1)各省級中心實驗室應(yīng)公布標本接收聯(lián)系方式，并實行24小時標本接收制；
(2)國家實驗室標本接收：
需送國家流感中心實驗室檢測的原始標本、病毒分離物、可疑陽性標本、血清等，填寫標本送檢登記表，在低溫保存條件下，于24小時內(nèi)送至中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所流感中心進行復(fù)核。國家流感中心標本接收聯(lián)系方式為：中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所，地址：北京市宣武區(qū)迎新街100號，聯(lián)系人：郭元吉、王敏，聯(lián)系電話：010-63534632，010-63581337，傳真：(010)63534632。
五、標本檢測方法
1.禽H5病毒核酸檢測：
材料：疑似禽流感患者的咽、鼻拭子或含漱液，死亡病例的尸檢肺組織、氣管分泌物。
方法：RT-PCR，用于禽H5亞型流感病毒的快速檢測、測序及排除工作試劑：特異性H5及甲型流感病毒的引物、病毒RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄酶、Taq DNA聚合酶等試劑,建議使用德國QIAGEN的Rneasy Mini Kit (病毒核酸提取)和QIAquick Gel Extraction Kit(PCR產(chǎn)物純化)產(chǎn)品。2.病毒分離及鑒定：
材料:疑似禽流感患者的咽、鼻拭子或含漱液，死亡病例的尸檢肺組織、氣管分泌物。
方法：采用雞胚和MDCK細胞分離方法，血凝及血凝抑制試驗(HAI)具體方法詳見國標《流行性感冒診斷標準及處理原則》。經(jīng)特異性H5 RT-PCR病毒核酸檢測陽性的采樣標本的病毒分離及鑒定工作必須在安全Ⅲ級(BSL-3級)實驗室里操作。
試劑：雞胚接種采用SPF雞胚，MDCK細胞等。
3.疑似病例的血清學(xué)檢測：
材料：疑似病例的急性期和恢復(fù)期的雙份血清
方法：血凝抑制實驗具體方法詳見國標《流行性感冒診斷標準及處理原則》。
試劑：H5滅活病毒。
4.微量中和試驗
材料：疑似病例的急性期和恢復(fù)期的雙份血清
試劑：H5活病毒，必須在生物安全Ⅲ級(BSL-3級)實驗室里操作。
六、檢測結(jié)果的確認
以下情況的原始標本及分離物送國家流感中心檢測、復(fù)核、確認。
1.標本分離物血凝實驗(HA)陽性，同時H5血凝抑制試驗(HI)陰性，H5的RT-PCR檢測陽性。
2.標本分離物血凝實驗(HA)陽性，同時H5血凝抑制試驗(HI)陽性或H5的RT-PCR檢測陽性。
3.標本分離物血凝實驗(HA)陽性，同時H5的RT-PCR檢測陽性。
4.病人恢復(fù)期血清比急性期血清的H5抗體有4倍或以上增高。
5.標本分離陽性，H5血凝抑制試驗陰性，并已排除了是當前流行的甲、乙型毒株的可能。
七、檢測結(jié)果報告
一般情況下,實驗室收到的樣本立即進行實驗，并于收到標本后24小時內(nèi)出具RT-PCR檢測報告，3-5天出具病毒分離培養(yǎng)結(jié)果，于分離到病毒后的3-5天出具流感病毒的血凝抑制結(jié)果，微量中和實驗須3-5天完成。當實驗過程中出現(xiàn)不可預(yù)測情況或意外事件，影響了按時出具報告時，應(yīng)及時報告和說明。
